?                                          生物醫(yī)藥行業(yè)的技術(shù)盛會

7月17-19日，由中國藥學(xué)會主辦的“第七屆中國藥學(xué)會生物技術(shù)藥物質(zhì)量分析研討會”盛大召開，來自生物醫(yī)藥及科研領(lǐng)域的多位專家及現(xiàn)場近300位行業(yè)人士相聚夏日炎炎的北京，共同探討生物醫(yī)藥行業(yè)內(nèi)的研究進展及前沿技術(shù)。

賽默飛色譜質(zhì)譜生物制藥業(yè)務(wù)發(fā)展經(jīng)理唐愷帶來《基于高分辨質(zhì)譜平臺的宿主細胞殘留蛋白（HCPs）檢測》的解決方案，助力生物醫(yī)藥行業(yè)解決HCPs分析難題。

賽默飛色譜質(zhì)譜生物制藥業(yè)務(wù)發(fā)展經(jīng)理唐愷

什么是HCPs？為什么需要關(guān)注HCPs？

重組蛋白類藥物是由遺傳修飾的原核或真核宿主細胞培養(yǎng)/發(fā)酵產(chǎn)生，由于細胞凋亡/死亡/裂解，其他非必需蛋白質(zhì)也可能釋放到細胞培養(yǎng)基/發(fā)酵液中，因此殘留在終產(chǎn)品中的其他蛋白質(zhì)即為宿主細胞殘留蛋白（HCPs）。

HCPs的存在會影響藥物的安全性和有效性，以及具有蛋白水解活性的HCPs影響藥物產(chǎn)品的穩(wěn)定性，因此生物醫(yī)藥公司不斷優(yōu)化其純化工藝，從而控制終產(chǎn)品中HCPs的種類和含量。

現(xiàn)有分析方法有哪些不足？

目前ELISA方法因其高靈敏度、高通量和易操作優(yōu)勢成為工業(yè)界的金標(biāo)準，但仍存在很多限制。包括：

1.不能對HCPs進行鑒定，低豐度HCPs的檢測易受限于高豐度蛋白的干擾；

2.定量動態(tài)范圍（3個數(shù)量級）較低，抗體受限，開發(fā)周期長；

3.無法改變已有的方法，缺少校正標(biāo)準限制定量的準確性，因此需多種檢測方法相結(jié)合。

高分辨質(zhì)譜技術(shù)的優(yōu)勢

隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)性能的不斷提升，已具有高靈敏度和寬的定量動態(tài)范圍，以及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，可實現(xiàn)對未知蛋白質(zhì)的高通量定性和定量。

Thermo Scientific™ Q Exactive™ Plus

組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀

基于nanoLC-MS/MS高靈敏平臺的方法，如何對HCPs進行準確定性和相對定量呢？

一、樣品前處理

2017年禮來制藥公司Huang, Lihua, et al.在Analytical Chemistry雜志上發(fā)表中的方法是，以NIST抗體標(biāo)準品為例，在蛋白質(zhì)非變性的條件下進行酶切，抗體主成分被部分酶切，酶切后經(jīng)90度高溫變性，未被酶切的部分將被沉淀去除，從而提高HCPs的鑒定幾率和方法的動態(tài)范圍。

我們在此基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化，縮短前處理時間提高工作效率，同時為考察此套流程對1-100ppm的HCPs的鑒定和相對定量能力，加入內(nèi)標(biāo)蛋白UPS2（48種蛋白，6個不同濃度）進行定性和相對定量。

圖1.樣品前處理流程示意圖（來自Huang, Lihua, et al.）

二、儀器、色譜柱、數(shù)據(jù)分析軟件

目前根據(jù)液相色譜的流速可分為納升液相色譜（nanoLC,<1µL/min）、毛細管液相色譜（capillaryLC,1-1µL/min）、微流速液相色譜（microLC,10-100µL/min）、分析流速液相色譜（LC,>100µL/min），由于樣品單位濃度和離子化效率依次下降，因此其靈敏度逐漸下降，本次實驗采用靈敏度zui高的納升液相系統(tǒng)。

三、實驗結(jié)果

1.定性結(jié)果：

內(nèi)標(biāo)蛋白UPS2中含有48種內(nèi)標(biāo)蛋白6個不同濃度，共鑒定其中24種，其實際含量結(jié)果如表1，含量范圍為0.05-444.88ppm，實際含量>1ng（10ppm）的16種內(nèi)標(biāo)蛋白全部鑒定到，實際含量在0.06-0.38ng（0.6-3.8ppm）范圍內(nèi)共鑒定到6種，此方案的靈敏度足以滿足生物藥領(lǐng)域客戶的需求。

表1.本次實驗中鑒定到UPS2內(nèi)標(biāo)蛋白的種類及其實際含量

2.蛋白相對定量結(jié)果：

本次實驗進行HCPs的相對定量，采用蛋白TOP3的特異性肽段峰面積的平均值算法，得出每種蛋白的峰面積，經(jīng)過三次技術(shù)重復(fù)，對特異性肽段大于等于1的蛋白峰面積進行統(tǒng)計，平均峰面積分布如圖3A，峰面積大于1e?的蛋白為此樣品的主抗體，可看出本實驗定量范圍達6個數(shù)量級。UPS2內(nèi)標(biāo)蛋白的峰面積與含量的分布如圖3B，峰面積與含量存在一定的線性關(guān)系， HCPs的相對含量可根據(jù)其峰面積進行初步判斷，進而優(yōu)化純化工藝。

圖3A.特異性肽段大于等于1的蛋白峰面積分布圖

圖3B.內(nèi)標(biāo)蛋白UPS2的峰面積（log2）與其含量的分布

基于UHPLC-MS/MS平臺的方法：

UHPLC-MS/MS對于低含量HCPs的檢測時，需提高上樣量（至少是納升液相系統(tǒng)的50倍）以提高其靈敏度。

經(jīng)實例驗證此方法同樣滿足當(dāng)前大部分需求，某抗體藥物的HCPs經(jīng)ELISA定量為5ppm，UHPLC-MS/MS能夠準確鑒定到6種HCPs（unique peptides≥2）,通過內(nèi)標(biāo)UPS2確定其檢測限達1ppm，6種HCPs的相對含量在1-10ppm內(nèi)。

小結(jié)

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的飛速發(fā)展，賽默飛Orbitrap高分辨質(zhì)譜，可采用納升液相，超液相兩種方式，定性和相對定量分析HCPs，LOD均低至1ppm以下，為傳統(tǒng)的ELISA方法補充更為豐富的信息，進一步幫助生物醫(yī)藥企業(yè)優(yōu)化純化工藝，監(jiān)控終產(chǎn)品和過程產(chǎn)物中的HCPs含量。